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UDI?UMI?來不及解釋了快上車[新品推薦]

【字體: 時間:2020年06月29日 來源:Takara

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  相信有些小伙伴已經隱隱約約有聽說過UDI和UMI這兩個英文縮寫,但是一直沒搞清楚它們全名是啥?它們能干啥?下面,就讓我們一起來“揭秘”UDI和UMI!

歡迎各位小伙伴“上車”,請大家系好安全帶,我們準備出發!

相信有些小伙伴已經隱隱約約有聽說過UDI和UMI這兩個英文縮寫,但是一直沒搞清楚它們全名是啥?它們能干啥?

下面,就讓我們一起來“揭秘”UDI和UMI!

UDI,即Unique Dual Index,譯為雙端唯一標簽技術
UMI,即Unique Molecular Identifier,譯為分子條形碼或者分子標簽技術

別急,要弄清這兩個概念,還得從二代測序的那些事情說起:

我們都知道二代測序技術是近十年來曝光率非常高、非常受關注的基因組分析技術。以Illumina為代表的測序儀廠商不斷推出更新型號的測序儀,不斷刷新測序通量,但不變的仍是多樣本混合后測序的策略。

要實現對多個樣本同時測序,必須在各樣本PCR擴增階段,往DNA片段上添加一段分子序列作為樣本標簽,這種標簽叫做index。

這樣,每個樣本就帶上屬于它的“專屬號碼牌”,在多樣本混合測序后,生信工程師能通過“翻牌”,確定這個“號碼”所代表的就是“尋尋覓覓”的那個“它”。

Index一般由8位堿基所組成,常有單端與雙端兩種添加模式,為了增加同時上樣的通量,大家一般在面臨大量樣本同時測序時,會選擇雙端index↓

目前常用的雙端index策略是通過少數幾種index序列排列組合,去實現更多樣本的標簽區分(如96種),但這種方式一直存在交叉污染的可能。

同時,為了進一步提升通量與擴增效率,降低測序成本,Illumina為Novaseq等高通量型測序儀引入了圖案化流動槽(Patterned Flow Cell Technology,PFCT)和排他性擴增(Exclusion Amplification,ExAmp)成簇技術。這兩個看似美好的技術卻無意間放大了一種叫做標簽跳躍(index hopping)的樣本標簽錯配的現象,導致科研人員無法正確拆析樣本與數據的關系,最終可能與重大發現“失之交臂”。

為了降低標簽跳躍,Illumina在白皮書[1]中提到可以使用UDI雙端特殊標簽對樣本進行標記,混樣后進行測序。

UDI的引入使得文庫兩端的index序列是唯一,且一對一組合的,不存在共用。換句話說,只有兩端帶有完全正確index序列的reads才能進入后續的樣本分析,從而可以剔除標簽錯配的reads,有效避免樣本之間的數據串擾。

一句話總結:采用UDI策略,能更正確拆解測序數據與樣本之間的一一對應關系,減小樣本“戴錯號碼牌”的概率

下面再來講講名為分子標簽技術的UMI:

UMI的原理就是給每一條原始DNA片段加上一段特有的標簽序列,經PCR擴增后一起進行測序。這樣根據不同的標簽序列,生信人員就能區分不同來源的DNA模板,分辨哪些是PCR擴增及測序過程中的隨機錯誤造成的假陽性突變,哪些是患者真正攜帶的突變,從而提高檢測靈敏度和特異性。


一些需要較高正確度的應用,如腫瘤稀有突變分析,常會對5%、甚至1%左右的稀有變異作檢測。這時一旦出現測序錯誤、或者PCR偏差,便會產生大量假陽性結果,因此需要添加UMI進行校正。

一句話總結:做稀有突變檢測、校正測序錯誤與PCR偏差,UMI“勞苦功高”

看到這里,領導交待我給大家科普UDI和UMI的任務已基本完成。

但領導說我要把下面的內容介紹完,才能恰飯↓

最近我們收到一位寶粉的來信,咨詢我們Takara有沒有什么好的文庫構建方案。

從email中我們了解到這位寶粉的團隊①最近正在研發腫瘤稀有突變分析的項目;②樣本類型主要是FFPE(石蠟包埋樣本)、cfDNA(游離DNA);③起始量大概在幾十ng;④準備自己建庫,然后送樣測序,平臺是Novaseq;⑤由于是剛接觸建庫實驗,不希望操作太復雜

我思考了大概1秒鐘,就從我們豐富的DNA-Seq文庫構建產品線中找到了一款合適的產品

ThruPLEX Tag-Seq HV

為什么說這款產品合適呢?我們來對標這位寶粉的幾個需求。

需求1:希望操作簡便,不要太繁瑣

對標1:ThruPLEX Tag-Seq HV這款試劑盒支持單管、三步操作,手動15 min,全程2 h,無需在建庫過程中轉管或純化。

我們比較了ThruPLEX HV和K、N兩家公司的試劑盒,只有ThruPLEX是單管操作、時間最短、操作最便捷的系統。

所以,無論新手還是老手,都能很快上手!

需求2:樣本類型為FFPE DNA、cfDNA,起始量大概在幾十ng

對標2:ThruPLEX Tag-Seq HV支持5-200 ng FFPE DNA、cfDNA起始,input volume為30μl,無需樣品濃縮。

需求3:Novaseq測序分析稀有變異

對標3:ThruPLEX Tag-Seq HV搭配UDI建庫,可以有效降低index hopping效應,是高通量型Illumina測序儀的“友好伙伴”。

ThruPLEX Tag-Seq HV莖環形接頭上還包含7位堿基的固定型UMI,雙端總共可有144種UMI連接到DNA分子兩端,以識別一致序列,減少擴增或者測序錯誤帶來的假陽性突變。

舉幾個栗子
 
Takara科學家采用ThruPLEX Tag-Seq HV對10 ng起始的Quan-Plex Patient-Like ctDNA標準品(AccuRef)構建文庫,腫瘤相關的基因采用IDT xGEN Pan Cancer Panel進行捕獲富集,隨后用UMIs鑒定了ctDNA標準品中特定位點的實際突變頻率。結果顯示,檢測到的突變頻率分別與預期1%、5%的等位突變頻率接近,而陰性對照組沒有在位點處檢測到任何突變。

同時,為了比較UMI與常規使用的坐標法之間的效果差異,Takara科學家先使用未去重或者僅用坐標法去重的文件分析,在預期的EGFR L858R突變附近觀察到大量的低頻及隨機等位基因頻率突變。而隨后用UMI校正、過濾數據后,清除了假陽性突變,得到了預期的突變分析結果!

經過幾場對標,我們明確了ThruPLEX Tag-Seq HV能滿足那位寶粉開發cfDNA/FFPE DNA稀有突變項目的需求。

當然,若小伙伴們也有同等需求,ThruPLEX Tag-Seq HV定能不負所望!

福利時間

如果您近期正好計劃開展稀有突變的DNA-Seq分析,正好又對我們ThruPLEX Tag-Seq HV感興趣:

您可以發送:您的姓名+單位+手機號+您想咨詢的問題,并備注“生物通”
[email protected]向我們咨詢

即日起至2020年7月31日,凡是向我們咨詢產品的小伙伴,
都可以獲得我們贈送的精美酒精噴壺一個↓

后疫情時代,噴噴手,噴噴桌面,遏制疫情反彈,都是非常實用的。

趕快來信咨詢吧!

深入了解Takara的ThruPLEX Tag-Seq HV及其他文庫構建產品>>

參考文獻:
[1] Illumina.Effects of index misassignment on multiplexing and downstream Analysis(white paper). 4(2017).

墻裂建議點擊:
Takara Bio中國官網

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