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最常出現的3個測序問題,就這樣輕松解決!

高通量測序技術加速了基因組學的發展,不過在測序過程中,相信不少人都會懷疑:我得到的信息是真實有效的嗎?不可否認的是,采用傳統技術進行測序,下列幾個問題常常導致數據無法真實地反映基因組的情況,為研究帶來困擾:


1、錯誤累積

采用PCR技術對DNA進行指數擴增,擴增過程中,由于難以避免的堿基錯配等原因會得到錯誤的DNA序列。這些錯誤的DNA序列又作為復制模板,進行下一輪的擴增,使得這些錯誤不斷累積。


2、易出現標簽跳躍(Index hopping)

多個樣本進行pooling測序時,需要加入index標簽,將得到的數據與樣本一一對應。基于ExAmp(排他性擴增)技術的測序平臺,在pooling上機時,易出現index hopping情況,比例高達1%。對于PCR-free文庫而言,該比例可高達6.5%[1],導致“張冠李戴”的現象發生。


3、引入重復序列(Duplicate reads)

雙端reads同時比對到參考基因組上相同的起始和結束位置的序列稱之為重復序列(Duplicate reads,下文縮寫為Dup)。文庫構建中的擴增、測序前的信號放大、測序過程中的光學過程等都會引入Dup。這些Dup并不能帶來額外的基因組信息,反而會影響變異結果的準確性,降低數據的有效性。


這些問題有沒有辦法解決?



如何避免PCR擴增錯誤累積和index hopping?


首先可以確定的是,在DNBSEQ平臺上,PCR擴增的錯誤幾乎不會得到累積,這是為什么呢?


還記得DNA的半保留復制嗎?每次擴增都以不同的DNA分子作為模板進行復制。而DNBSEQ平臺基于獨特的滾環擴增技術,每次擴增時都以同一個單鏈環狀DNA分子為模板,使用保真性極高的聚合酶完成DNA片段的擴增。即便某次擴增時,某個位置發生了堿基錯配,這個錯誤也不會繼續累積,有效避免PCR擴增錯誤指數累積的問題。

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圖1 滾環擴增技術示意圖


同樣,在DNBSEQ平臺上,當樣品帶有index時,index部分發生的PCR擴增錯誤一樣不會累積,避免數據匹配到錯誤的樣本上,解決index hopping問題。

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圖2 滾環擴增,發生的錯誤不會累積




如何降低Dup,提高數據準確性和有效性?


對隨機挑選的DNBSEQ平臺27,873個人重測序商業樣本進行Dup率統計分析,Dup率平均值低至2.54%(圖3)。相比在其他平臺上測序,文庫經過環化后在DNBSEQ平臺上測序,Dup率更低(圖4)。


超低Dup率意味著拿到的數據更加真實,有效數據占比更高。DNBSEQ平臺采用DNBSEQTM 技術,主要從以下兩個方面降低Dup率:


① 文庫構建完成后,我們得到了無數條帶有測序接頭的雙鏈DNA分子。DNBSEQ平臺進行測序準備時,只環化雙鏈DNA分子中的一條,另外一條則被核酸外切酶消化,不用于形成DNA納米球,降低Dup率。


② DNA納米球通過特殊蛋白質介導分子結合到“平坦”的芯片表面,酶、dNTP等反應原料在“平坦”的芯片表面的更新效率高,生化反應更加充分,各位點的信號強度相對平均,生化反應不完全的位點信號不會被反應充分的位點信號掩蓋,大大降低光學Dup的發生幾率。

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圖3 27,973個人重商業樣本Dup率統計


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圖4 其他平臺文庫在DNBSEQ平臺及其他平臺上測序Dup率比較


PCR擴增錯誤不會被積累、不用擔心樣本之間發生數據污染、超低Dup、數據的有效性超高。最讓人擔心的3大測序問題,就這樣被DNBSEQ平臺輕松解決啦!如此優秀的平臺,促銷正在火熱進行中,7.1-8.31送樣,前200條lane超低嘗鮮價,趕緊掃描海報二維碼或點擊按鈕即刻報名,鎖定優惠!


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參考文獻:
[1] Costello M, Flehaty M, Abreu J, et al. Characterization and remediation of sample index swaps by non-redundant dual indexing on massively parallel sequencing platforms. BMC Genomics, 2018 May 8; 19(1):332.


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